Proyecto I+D+i 2020 «Generación de Conocimiento»: Función de las hemoglobinas en la simbiosis rizobio-leguminosa en condiciones fisiológicas de estrés nutricional.

8 Mayo 2023

La percepción de que las hemoglobinas son exclusivas de los animales resultó ser incorrecta con el descubrimiento de estas proteínas en plantas y bacterias. Las primeras hemoglobinas vegetales se encontraron en los nódulos de las leguminosas, unas estructuras que se forman en las raíces como resultado de la simbiosis entre esta familia de plantas y unas bacterias del suelo conocidas genéricamente como rizobios (Figura 1). En los nódulos, los rizobios experimentan transformaciones morfológicas y metabólicas denominándose bacteroides. Los bacteroides expresan un complejo enzimático, la nitrogenasa, capaz de reducir ("fijar") el nitrógeno atmosférico a amonio, una forma de nitrógeno asimilable por la planta. Este proceso se conoce como fijación simbiótica de nitrógeno. A cambio, la planta le suministra al bacteroide compuestos carbonados procedentes de la sacarosa que sintetiza en las hojas durante la fotosíntesis. Los compuestos carbonados (ácidos orgánicos) los utiliza el bacteroide para producir la energía necesaria para la fijación de nitrógeno. Es decir, la simbiosis consiste, esencialmente, en el intercambio de carbono y nitrógeno entre la bacteria y la planta. La fijación de nitrógeno es una auténtica fertilización biológica, con enormes ventajas sobre la fertilización química tanto desde el punto de vista económico como medioambiental, puesto que los fertilizantes nitrogenados son muy costosos de producir y, cuando se aplican en exceso, pueden contaminar los ecosistemas y el agua de consumo por lixiviación en el suelo.

Figura 1
Figura 1. Del campo a la molécula. (A) Cultivo de plantas de soja noduladas sin aporte de fertilizante nitrogenado. (B) Nódulos en las raíces. (C) Sección transversal de un nódulo en la que se observa una elevada concentración de hemoglobina simbiótica (leghemoglobina) en la zona central fijadora de nitrógeno. (D) Sección de nódulo al microscopio en el que las células infectadas aparecen repletas de bacteroides, marcados con una sonda fluorescente en color magenta. (E) Ampliación de la anterior imagen, en la que se observan células infectadas en color magenta. (F) Estructura 3D de la leghemoglobina, en la que se aprecia el grupo hemo, con los átomos en magenta y rojo.

Los nódulos contienen una alta concentración de hemoglobinas "simbióticas" (también denominadas leghemoglobinas), lo que les confieren un color rojo en la zona central (Figura 1). Estas leghemoglobinas transportan oxígeno (Figura 2) en el citoplasma de las células hasta los bacteroides a una concentración baja pero estable, que permite una alta respiración, si bien evitando al mismo tiempo la inactivación de la nitrogenasa, muy sensible al oxígeno. Más recientemente, con la secuenciación masiva de los genomas, se ha observado que las hemoglobinas están presentes en todas las plantas y distribuidas en todos sus órganos, incluidas semillas, raíces, hojas, flores y frutos. Estas hemoglobinas se denominan "no simbióticas" y son de tres clases según sus secuencias de aminoácidos y propiedades bioquímicas (Figura 3). En el caso de las hemoglobinas de clase 1, se ha encontrado una función: la regulación de la concentración de óxido nítrico, una molécula señal de enorme importancia en todos los organismos. Esta función permite a las plantas hacer frente a la hipoxia producida por la inundación de las raíces.

Figura 2
Figura 2. Esquema de dos funciones importantes de la leghemoglobina. Para simplificar se representa solo el grupo hemo con una histidina coordinada en la parte inferior. (A) Transporte de oxígeno (O2). (B) Actividad "óxido nitríco dioxigenasa". En el grupo hemo de la proteína se combina el óxido nítrico (NO) con el O2 para producir nitrato (NO3-). Se observa que en (A) el hierro se mantiene en estado ferroso (Fe2+), mientras que en (B) hay una oxidación a estado férrico (Fe3+).

Las hemoglobinas, posibles partícipes en la respuesta a estrés por la deficiencia de nutrientes y el estrés oxidativo.

En este proyecto, financiado por la AEI, se estudia en detalle las leghemoglobinas y las tres clases de hemoglobinas no simbióticas. Para estos estudios, se utiliza una leguminosa modelo (Lotus japonicus) cuyo genoma está totalmente secuenciado. Mediante una colaboración internacional en la que se ha empleado la tecnología CRISPR/Cas9 de edición genómica, se han obtenido y seleccionado plantas mutantes deficientes en cada una de las hemoglobinas.

El primer objetivo es estudiar las alteraciones fisiológicas y bioquímicas de los mutantes para obtener información sobre las funciones de las hemoglobinas. Los resultados preliminares indican que las hemoglobinas no simbióticas están involucradas en el desarrollo de las plantas ya que los mutantes muestran retrasos en la floración y fructificación. Además, los mutantes responden de manera diferente a dos tipos de nutrición nitrogenada (fijación de nitrógeno y nitrato). Para determinar las causas de las alteraciones del crecimiento de los mutantes, se obtendrán los perfiles de metabolitos (metabolómica) de las plantas, haciendo especial hincapié en las hormonas. El segundo objetivo es averiguar si los mutantes son más sensibles a varios tipos de estrés. Y el tercer y último objetivo es determinar la estructura tridimensional de las hemoglobinas no simbióticas mediante su cristalización y análisis por difracción de rayos X. Esta información estructural es de suma importancia para elucidar las funciones de las proteínas y correlacionarlas con sus propiedades bioquímicas.

Los resultados previsibles del proyecto nos proporcionarán una información muy valiosa sobre las funciones de las hemoglobinas de las plantas. La hipótesis de trabajo de los investigadores es que las hemoglobinas están involucradas en la respuesta a estrés por la deficiencia de nutrientes y el estrés oxidativo. Este último se produce por un desequilibrio entre la producción de radicales libres y antioxidantes y puede ser causado, a su vez, por numerosos estreses, incluido el nutricional. Si esta hipótesis es correcta, el aumento del contenido de hemoglobinas de las plantas, probablemente en una etapa de desarrollo y en un tejido concreto, podría tener un efecto beneficioso en la tolerancia a estrés y en la producción vegetal. Por tanto, el proyecto tiene objetivos de interés, en general, en el área de la biología vegetal y, en particular, para la mejora de la fijación de nitrógeno de las leguminosas y la agricultura sostenible.

Figura 3
Figura 3. Clasificación de las hemoglobinas de plantas. Se indican las tres clases de hemoglobinas no simbióticas, que son ubicuas en los tejidos vegetales, y las simbióticas, que derivan evolutivamente de las no simbióticas de clase 2 y que se encuentran exclusivamente en los nódulos de las leguminosas y de otras plantas denominadas actinorrícicas, como el aliso o la casuarina.

 

Investigadores/as Principales del proyecto
Manuel Becana

Manuel Becana es profesor de investigación en la Estación Experimental de Aula Dei-CSIC de Zaragoza. Durante toda su carrera científica ha trabajado en la fijación de nitrógeno por la simbiosis rizobio-leguminosa, en aspectos relacionados con el metabolismo de los radicales libres y antioxidantes, el desarrollo y la senescencia de los nódulos, la respuesta a estreses abióticos y la estructura y función de las hemoglobinas en leguminosas modelo y cultivadas. Es autor principal o coautor de unos 100 artículos en revistas de alto impacto en biología vegetal, y hasta el año pasado ha presidido la Sociedad Española de Fijación de Nitrógeno (SEFIN).

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